高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）的基本流程

                           高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）的基本流程
  在“色谱原理”的相关章中已略述了HPLC与经典的液相色谱之间的差异。经典的液相色谱采用的固定相粒度范围大，形状不规则，分离的组分在术中扩散厉害。同时，分离的组分在固定相中受到阻力大，滞留时间长，谱带加宽，分离效果差，而且每根色谱柱仅能分离一次样品，消耗大。另外，经典的液相色谱借助于流动的重力或其它的简单装置让流动相自上而下地流过色谱柱，又未能采用高灵敏度的检测器，存在分析速度慢、灵敏度低的缺点。
  用经典的液相色谱分析氨基酸，近2m长，1cm粗的玻璃柱，固定相为离子交换树脂，用去流动相近1000mL,花费20h分离了20种氨基酸。继而英国科学家马廷用一根30cm长的玻璃柱，液-液分配色谱方法分离子氨基酸。为此他获得了1952年诺贝尔化学奖。
  有HPLC分离氨基酸，20cm长，4.6mm内径的不锈钢柱，内填0.7um的HPLC用的固定相，仅30min，用去流动相15mL分离出近20种氨基酸。
  神奇的HPLC神奇在哪里？
  这种神奇在于固定相，也称HPLC填料。HPLC采用5 ~ 10um小颗粒的球形填料，常用的是球形硅胶，无论是键合的，还是未键合的，都有一定的孔径和较大的比表面积，粒度很均匀。
  一根25cm长，内径为4.6mm的HPLC柱可达数万个理论塔片，比经黄的液相色谱柱高出3—4个数量级的柱效，可分离上百个组分。因分辨率高，在一长色谱图上可容纳很多的色谱峰。
  HPLC填料除了颗粒细、阻力小、传力快、分离效果好外，还有各种不同性能的填料，为分离各种性能不同的组分提供了条件。
  HPLC的色谱柱是封闭式、小尺寸，在同一根色谱柱可反复进样品数百次分析测定，配上性能优良的高压输液泵，使流动相快而稳定地通过色谱柱，分析速度快，结果更准确。
  HPLC的高压部分处于全封闭状态，从进样到检测组装在一个系统中，减少了对环境的污染，易于实现自动化和半自动化操作，更省力省时。
  由于以上种种优点，HPLC更适合于高沸点、大分子、极性强和热稳定性差的组分的分离和分析，所以HPLC获得广泛的用途。
  1、HPLC装流动相的储液器
  HPLC的储液器用200—1000mL的优质玻璃瓶或者石英瓶。注意保持储液器的清洁，除了定期清洗外，每次更换新的流动相前都要清洗掉原使用的流动相残留。新配好的流动相要在特制的抽滤瓶中抽滤掉可能损坏泵和污染色谱柱的杂质颗粒，可部分抽去溶解于流动相中的空气。
  脱气很重要，因为溶解于流动相中的空气会影响色谱系统的性能：在泵中聚积气泡使压力不稳致流速不稳，气泡进入检测器会吸附在检测器池壁上，增加检测器噪声，降低灵敏度甚至信号消失。流动相中有O2对光电检测器的影响最大，使紫外检测器的基流增大，在低波长检测时信号被子低消掉。在荧光检测器中O2会熄灭组分的荧光，降低灵敏度。在还原型的电化学检测器中存在O2会阻挠反应的进行。
  用水配制的流动相极易溶解进空气能达到饱和状态，而无水的流动相（正相色谱）不存在这个问题。
  抽滤法脱气只是暂时性的，使用过程中空气又溶入流动相，最有效的方法为在线氦脱气。氦不溶于流动相，将氦缓缓地通往流动相能赶出溶入的空气，通氦10min可除去80% ~ 90%溶入的气体，效果极佳。继续地通入小流量的氦气可防止空气再溶入和反扩散。
  有一个典型的例子，可以看到空气对紫外检测器和荧光检测器的影响，以可以看到氦脱气后的效果。用反相色谱方法，固定相为C8键合相填料，流动相为水-乙腈，测定组分为萘。开始氦脱气，萘在紫外检测器和荧光检测器的出峰信号正常。停止氦脱气，紫外检测器的基线抬高，荧光检测器的信号变小。再开始氦脱气，两个检测器的信号慢慢恢复正常。
  2、 HPLC的输液泵
  曾经有多种类型的HPLC输液泵。这里仅介绍目前常用的往复式恒流柱塞泵。
  这种泵主要由人造宝石的柱塞杆、人造宝石单向阀和密封垫圈等组成，接在发动机上的凸轮驱动有弹簧装置的柱塞杆来回运动。
  进口单向阀安装在泵的底部，出口单向阀同向安装在泵的上部，这样有利于气泡的排出。安装在流动相进口端，宝石座与落下的宝石球成切线密封，宝石球弹起时又为筛网所挡。密封垫圈是用聚合物加耐磨物质制成的。密封垫圈质软，外侧紧紧地嵌在泵体中，内侧紧紧地包裹住光滑的人造宝石杆。因柱塞杆不断运动，密封垫圈需要经常更换，属正常消耗品。
  吸进流动相  当凸轮渐渐脱离柱塞杆，因弹簧作用，柱塞杆由泵腔向外运动，泵腔压力较低，进口单向阀的宝石球弹起来，而相同方向的出吕单向阀的宝石球在大气压力的作用下紧紧与阀座相切而密封。流动相不断流入泵腔中。
  排出流动相 凸轮转动一周后又渐渐挤紧柱塞杆，迫使用权柱塞杆向泵腔内运动，进口单向阀关闭，出口单向阀打开，流动相被打入色谱柱内。
  若是用一个单柱塞泵吸液和排液脉冲很大。为了减小脉冲可用双泵式柱塞泵，一个泵吸液，另一个泵排液，两泵相关180°，加上流速调节器和压力传感器，可使压力变化更和谐，运动曲线近似一条直线。
  流动相经高压泵输液后进入进样器，再到色谱柱和检测器，这部分均呈密封高压状态，所有部件要能承受5—15MPa或更高的压力，其管道和接头都是耐压的不锈钢材料。
  3、HPLC的进样器
  GC可以采用柱头进样器进样，因为GC的压力小，只要有一定的进样技巧就可以获得良好的分析结果。而在HPLC中采用柱头方式进样，因在高压状态下困难很大，难以获得精确的结果。
  六能平面进样阀是HPLC最理想的进样器，在HPLC系统中的位置所示。
  六能平面进样阀的主要部件是阀的后盖不锈定子和用高聚物复合材料制成的转子。转子耐磨而密封性能好，紧紧压在定子上。定子有六个均匀的小孔，孔与孔之间的夹角为60°，可以先看一看定子通道的连接法：孔1进样，孔2排出多余样品，；孔3、孔6连接定量的样品管；孔4接泵；孔5到色谱柱。
  六能平面进样阀有两种方式：外装式进样和内装式进样，定子一样，区别在转子的导槽上。内装式进样死体积小，样品用量少，多采内装式六能平面进样阀。但有时需要在线分析或自动化分析还是要用外装式六通平面进样阀。
  4、HPLC的色谱柱
  术是HPLC系统的心脏部件，许多分离问题都归于柱。根据要分离的理化性质决定用什么样的色谱柱，也就确定了采用何种色谱方法。